Prueba de PCR en la Neumonía

Tema: Discriminación basada en PCR de los serotipos emergentes Streptococcus pneumoniae 22F Y 33F.

Objetivo: Detectar y diferenciar de manera precisa y reproducible los serotipos 22F y 33F de S. pneumoniae a partir de serotipos genéticamente similares por PCR. 

Muestra biológica: Cultivo bacteriano.

Tipo de ácido nucleico: ADN neumocócico.

Extracción: Kit Taqman Universal PCR Master Mix.

Gen implicado: locicps de los serotipos 22F (CR931682.1), 22A (CR931681.1), 33F (CR931702.1),  33A (CR931698.1) y 37 ( AJ131984.1).

Pares de bases: 399 pb que abarca los genes wcwA y wcwC del serotipo 22A ( wcwA / C _22A ), una  región de 250 pb del serotipo 22F wcwA ( wcwA _22F ), una  región de 148 pb del serotipo 22F wcwC ( wcwC _22F ) y un  control interno de 643 pb ( wcwV). Para la detección y diferenciación de los serotipos 33F y 33A, los cebadores se diseñaron para dirigirse a una región de 593 pb de wcjE y 186 pb para 37.

Tipo de PCR: cmPCR.

Pasos:

-Desnaturalización: 95  ° C durante 15  min.

-Hibridación: 54  ° C durante 90  s.
-Extensión: 72  ° C durante 60  s.

-Extensión final: 72  ° C durante 10 min.

-Número de ciclos: 35  ciclos de desnaturalización a 94  ° C durante 30  s.

Todas las amplificaciones de ADN se realizaron en placas de 96 pocillos en un termociclador C1000 Touch (BioRad Laboratories Inc., Mississauga, ON). Amplicon DNA se almacenó a 4 ° C hasta su uso.  

Visualización: Corrido electroforético.

Resultados representativos para la discriminación basada en PCR de los serotipos22F / 22A o 33F / 33A / 37. A) Reacciones PCR representativas para los serotipos 22F y 22A. Los carriles 1 a 4 representan reacciones de PCR monoplex para los objetivos wcwV (carril 1); wcwA / C 22A (carril 2); wcwA 22F (carril 3), wcwC 22F (carril 4); el carril 5 representa el cmPCR para todos los objetivos; y carril 6 el control negativo para el cmPCR. B) Reacciones de PCR representativas para los serotipos 33F, 33A y 37. Las calles 1 a 3 representan reacciones de PCR monoplex para wzy (carril 1); wcjE (carril 2); tts(carril 3); el carril 4 representa el cmPCR para todos los objetivos; y carril 5 el control negativo para el cmPCR. Para los controles positivos, se usaron las siguientes cepas de referencia NML para S. pneumoniae : SC0291 (serotipo 22F) y SC0059 (serotipo 22A) para el 22F / A cmPCR, y SC0082 (serotipo 33A), SC0065 (serotipo 33F) y SC0086 ( serotipo 37) para el 33F / 33A / 37 cmPCR. Los controles negativos fueron eluidos de la extracción de ácido nucleico realizada con agua de grado PCR. Los tamaños de amplicones se compararon con una escalera de ADN Invitrogen de 100 pb.

Referencias bibliográficas:

1. Gillis H, Demczuk W, Griffith A, Martin I, Warhuus M, Lang A et al. PCR-based discrimination of emerging Streptococcus pneumoniae serotypes 22F and 33F. Journal of Microbiological Methods [Internet]. 2018 [cited 25 November 2017]; 144:99-106. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016770121730310X
2. Aman M. LIBRO DE APOYO DIDACTICO EN BIOLOGIA MOLECULAR FCM UCE marzo 2015 [Internet]. Joomag. 2015 [cited 25 November 2017]. Available from: https://view.joomag.com/libro-de-apoyo-didactico-en-biologia-molecular-fcm-uce-marzo-2015/0169164001409963499?short