Prueba de PCR en la Neumonía

Tema: Discriminación basada en PCR de los serotipos emergentes Streptococcus pneumoniae 22F Y 33F.

Objetivo: Detectar y diferenciar de manera precisa y reproducible los serotipos 22F y 33F de S. pneumoniae a partir de serotipos genéticamente similares por PCR. 

Muestra biológica: Cultivo bacteriano.

Tipo de ácido nucleico: ADN neumocócico.

Extracción: Kit Taqman Universal PCR Master Mix.

Gen implicado: locicps de los serotipos 22F (CR931682.1), 22A (CR931681.1), 33F (CR931702.1),  33A (CR931698.1) y 37 ( AJ131984.1).

Pares de bases: 399 pb que abarca los genes wcwA y wcwC del serotipo 22A ( wcwA / C _22A ), una  región de 250 pb del serotipo 22F wcwA ( wcwA _22F ), una  región de 148 pb del serotipo 22F wcwC ( wcwC _22F ) y un  control interno de 643 pb ( wcwV). Para la detección y diferenciación de los serotipos 33F y 33A, los cebadores se diseñaron para dirigirse a una región de 593 pb de wcjE y 186 pb para 37.

Tipo de PCR: cmPCR.

Pasos:

-Desnaturalización: 95  ° C durante 15  min.

-Hibridación: 54  ° C durante 90  s.
-Extensión: 72  ° C durante 60  s.

-Extensión final: 72  ° C durante 10 min.

-Número de ciclos: 35  ciclos de desnaturalización a 94  ° C durante 30  s.

Todas las amplificaciones de ADN se realizaron en placas de 96 pocillos en un termociclador C1000 Touch (BioRad Laboratories Inc., Mississauga, ON). Amplicon DNA se almacenó a 4 ° C hasta su uso.  

Visualización: Corrido electroforético.

Resultados representativos para la discriminación basada en PCR de los serotipos22F / 22A o 33F / 33A / 37. A) Reacciones PCR representativas para los serotipos 22F y 22A. Los carriles 1 a 4 representan reacciones de PCR monoplex para los objetivos wcwV (carril 1); wcwA / C 22A (carril 2); wcwA 22F (carril 3), wcwC 22F (carril 4); el carril 5 representa el cmPCR para todos los objetivos; y carril 6 el control negativo para el cmPCR. B) Reacciones de PCR representativas para los serotipos 33F, 33A y 37. Las calles 1 a 3 representan reacciones de PCR monoplex para wzy (carril 1); wcjE (carril 2); tts(carril 3); el carril 4 representa el cmPCR para todos los objetivos; y carril 5 el control negativo para el cmPCR. Para los controles positivos, se usaron las siguientes cepas de referencia NML para S. pneumoniae : SC0291 (serotipo 22F) y SC0059 (serotipo 22A) para el 22F / A cmPCR, y SC0082 (serotipo 33A), SC0065 (serotipo 33F) y SC0086 ( serotipo 37) para el 33F / 33A / 37 cmPCR. Los controles negativos fueron eluidos de la extracción de ácido nucleico realizada con agua de grado PCR. Los tamaños de amplicones se compararon con una escalera de ADN Invitrogen de 100 pb.

Referencias bibliográficas:

1. Gillis H, Demczuk W, Griffith A, Martin I, Warhuus M, Lang A et al. PCR-based discrimination of emerging Streptococcus pneumoniae serotypes 22F and 33F. Journal of Microbiological Methods [Internet]. 2018 [cited 25 November 2017]; 144:99-106. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016770121730310X
2. Aman M. LIBRO DE APOYO DIDACTICO EN BIOLOGIA MOLECULAR FCM UCE marzo 2015 [Internet]. Joomag. 2015 [cited 25 November 2017]. Available from: https://view.joomag.com/libro-de-apoyo-didactico-en-biologia-molecular-fcm-uce-marzo-2015/0169164001409963499?short

Pruebas confirmatorias y de tamizaje en la Neumonía

El diagnóstico de la neumonía requiere un conjunto de síntomas y signos clínicos y un infiltrado radiológico, con o sin apoyo de datos microbiológicos. Los estudios microbiológicos pueden apoyar el diagnóstico del agente infeccioso, pero los exámenes rutinarios demuestran frecuentemente resultados falsos negativos y también son inespecíficos. Sin embargo, estos estudios se justifican por múltiples razones. Cuando son positivos, el espectro de antibióticos elegido puede ajustarse; el hallazgo de algunos agentes puede tener otras implicaciones y también la acumulación de información sobre sensibilidad de los gérmenes a nivel local es de extraordinaria utilidad para las recomendaciones de terapia empírica.

PRUEBA DE TAMIZAJE 

Para que una enfermedad sea candidata a ser rastreada mediante una prueba de tamizaje se deben cumplir ciertos criterios de Frame y Carlson.

• Que la enfermedad que se está rastreando sea una causa común de morbimortalidad.
• Que la enfermedad sea detectable y tratable en etapas presintomáticas.
• Que las pruebas para su diagnóstico sean efectivas y eficaces.
• Que el tratamiento temprano sea mejor que el tratamiento en la etapa sintomática.
• Que el daño potencial de la intervención sea menor que el tratamiento no precoz.

La prueba más utilizada para el tamizaje de esta enfermedad es la radiografía de tórax

Esta prueba es rápida, no invasiva versátil y sobre todo económica.

Su sensibilidad se encuentra entre el 40% y 60% y su especificidad es mayor del 90% y tiene un alto valor predictivo negativo o positivo.

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

Se emplean para llegar a un diagnóstico definitivo de la enfermedad. En el caso de la neumonía, se puede realizar las siguientes pruebas:

• Hemocultivos: Los hemocultivos tienen una posibilidad que fluctúa entre el 4% y el 18% en pacientes hospitalizados con NAC, siendo S. pneumoniae el germen más frecuente aislado.
• Biopsia pulmonar por punción.
• Cultivo rutinario de esputo.
• Examen de anticuerpo fluorescente directo en esputo (AFD).
• Cultivo de líquido pleural.
• Tinción de Gram en esputo.

Referencias bibliográficas:

1. Mehrian P e. High-resolution computed tomography findings in chronic eosinophilic vs. cryptogenic organising pneumonia. - PubMed - NCBI [Internet]. Ncbi.nlm.nih.gov. 2017 [cited 19 November 2017]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29037300
2. Horita N e. Sensitivity and specificity of the Streptococcus pneumoniae urinary antigen test for unconcentrated urine from adult patients with pneumonia: a met... - PubMed - NCBI [Internet]. Ncbi.nlm.nih.gov. 2013 [cited 19 November 2017]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23910720
3. Punción B. Biopsia pulmonar por punción: MedlinePlus enciclopedia médica [Internet]. Medlineplus.gov. 2017 [cited 19 November 2017]. Available from: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003860.htm
4. Esputo C. Cultivo rutinario de esputo: MedlinePlus enciclopedia médica [Internet]. Medlineplus.gov. 2017 [cited 19 November 2017]. Available from: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003723.htm
5. (AFD) E. Examen de anticuerpo fluorescente directo en esputo (AFD): MedlinePlus enciclopedia médica [Internet]. Medlineplus.gov. 2017 [cited 19 November 2017]. Available from: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003553.htm
6. Pleural C. Cultivo de líquido pleural: MedlinePlus enciclopedia médica [Internet]. Medlineplus.gov. 2017 [cited 19 November 2017]. Available from: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003725.htm
7. Esputo T. Tinción de Gram en esputo: MedlinePlus enciclopedia médica [Internet]. Medlineplus.gov. 2017 [cited 19 November 2017]. Available from: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003765.htm

Ejemplo de alteración en la epigenética de la neumonía

Estudios han demostrado que los afrodescendientes son menos susceptibles a presentar neumonía, gracias a la proteína C reactiva esto indica la epigenómica en cuanto a su linaje, pero contradictoriamente los continentes más afectados son África y Asia.

Las propiedades antiinfecciosas de la proteína C reactiva (PCR) incluyen el reconocimiento de moléculas extrañas, la activación del complemento y la unión a la fosfocolina. Los altos niveles séricos son protectores y se correlacionan con la evolución clínica.

Mukamal y colaboradores encontraron en pacientes de raza negra que el haplotipo 790A/1919A/2667G/3872G/5237A del gen de la PCR se asociaba a una disminución en la susceptibilidad de la NAC (OR 0,5; IC 95% 0,3-0,9).

Referencias bibliográficas:

1. Neumonía [Internet]. Organización Mundial de la Salud. 2016 [citado 11 Noviembre 2017]. Disponible en: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/es/
2. Cardinal P, Rieppi G, Bengochea M. Medicina genómica aplicada a la neumonía aguda comunitaria [Internet]. Scielo.edu.uy. [cited 11 November 2017]. Available from: http://www.scielo.edu.uy/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1688-03902011000100007

Alteraciones de la traducción en la Neumonía

En la traducción del streptococcus pneumoniae se da la síntesis de las proteínas WZD/wze las cuales están encargadas de la virulencia de esta patología y de su resistencia en cuanto a su cubierta contra los antimicrobianos por ejemplo; betalactámicos, macrólidos,azálidos y fluroquinolasas. La síntesis de estas proteínas se debe a que los genes que codifican el polisacárido se encuentra organizados en un mismo operón. 
El objetivo es buscar péptidos de acción inhibitoria que desactiven los genes o la interferencia de la interacción WZD/wze cuando se expresan mediante un plásmido.

Referencias bibliográficas:

1. Tokarz R, Briese T, Morris G, Ideh R, Chimah O, Ebruke B et al. Serotype Analysis of Streptococcus pneumoniae in Lung and Nasopharyngeal Aspirates from Children in the Gambia by MassTag PCR: Table 1. Journal of Clinical Microbiology [Internet]. 2012 [citado 3 Noviembre 2017]; 51(3):995-997. Disponible en: http://jcm.asm.org/content/51/3/995.full